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 為活細胞研究設計光學顯微系統(tǒng)時，首要考慮的是檢測器的敏感度（對信號乃至噪音的檢測），圖像獲取的速度，以及在此基礎上標本的可行性。對于固定細胞的成像，曝光時間及光強度相對來說都很高，這時可能會造成光漂白；然而對于活細胞成像，上述光的影響必須去除。幾乎在所有情況下，活細胞顯微鏡都會在盡可能高的圖像質量與盡可能好的細胞活性之間取得一個平衡。對于此類實驗，時間及空間上的分辨率需要設定在能滿足實驗要求的水平上，而不是給予過度的光照或設定過多采樣時間點。

 

 

 

基本上,一個理想的活細胞成像系統(tǒng)必需有足夠的敏感度，來滿足在弱熒光條件下仍能得到高圖片質量；同時，系統(tǒng)也必需足夠快，以記錄整個動態(tài)過程。 另外，這個系統(tǒng)還需要有足夠高的分辨率以捕捉樣品細節(jié)，并且能夠準確的實時測量每個微小的光強變化。然而不幸的是，要改善上述的任意一條都需建立在犧牲其它性能的基礎上。因此現(xiàn)在還不能夠設計出一個可以滿足所有要求的活細胞成像體系。研究人員現(xiàn)在只能在盡量減低不重要的信息的遺失的同時，盡可能的獲得zui優(yōu)的重要參數(shù)。這樣，顯微鏡的配置zui終取決于成像的要求，對于樣品在實驗期間活性的要求，進行標記的難度水平，以及儀器的可用性等實際因素。

如圖一（Figure 1）所示為一臺倒置研究級顯微鏡，它配有四個相機接口，并可滿足對培養(yǎng)的組織的研究。在四個接口上分別配有四個不同的相機，每一個都用來獲取不同的圖像。在大多數(shù)情況下，這種顯微鏡的分光設計是100％進入相機或以80：20的比例同時分配給相機和目鏡。在弱光成像時，研究人員必需確保將zui敏感的相機接在100％分光口上。在圖一中，彩色CCD（Full color CCD）接在顯微鏡的底部（a），它從物鏡接受的光信號不經(jīng)過棱鏡或反光鏡的反射。這樣的相機通常用來進行多色熒光或明場拍攝。顯微鏡右側連接的電子倍增電荷偶聯(lián)設備（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用來檢測極弱的熒光信號。接在顯微鏡左側的相機（c）配有一個高量子效應的感應器，可以感應700－1000nm 波長范圍內(nèi)的光，所以這個相機可以用來進行微分干涉相稱（differential interference contrast，DIC）觀察方法下厚標本的紅外線照明成像。zui后，對于高分辨率的單色熒光成像，如全內(nèi)反射熒光或其它熒光技術，圖一中的顯微鏡在前部（d）配備了Peltier-cool 相機。這個相機zui小像素點為6μm，適合于此類成像的需求。如圖一中的配置非常昂貴，但是它能滿足用戶所有的成像要求。

進行活細胞成像的光學顯微鏡需要寬光譜增稱模塊。大多數(shù)的研究者使用熒光顯微鏡，通常還會配合一種或多種透射光技術。其中熒光技術包括了傳統(tǒng)的寬視場落射熒光，激光掃描共聚焦，真空碟片共聚焦，場掃描共聚焦，多光子，全內(nèi)反射（TIRF），熒光關聯(lián)光譜，熒光壽命成像（FILM），光活化，鐳射陷阱等技術。相應的成像技術有光譜成像，多色成像，共定位，時間序列，熒光光漂白恢復，（FRAP，FLIP，FLAP），熒光共振能量轉移（FRET），熒光散斑顯微鏡，膜片鉗技術等，以上這些技術通常要配合一種或多種基礎成像技術。當熒光與明場,DIC,霍夫曼調(diào)制相稱（HMC）,相差等技術相結合時,熒光技術作為探針,可用于定位.對于絕大多數(shù)的活細胞成像來說,顯微鏡的配置都需要滿足一些特定的需要以保證試驗能夠成功進行。除了顯微鏡與數(shù)字成像系統(tǒng)，活細胞成像還需要考慮到兩個限制因素——一個是保持細胞的活性，另一個是在北京噪音及自發(fā)熒光的基礎上盡可能的提高信號強度。

提高活細胞成像的信噪比

活細胞成像與固定細胞成像之間的基本區(qū)別是，后者的成像沒有過多的限制， 如合適視野的選定，曝光時間的設定，電子益增的設定，讀出率及,偏移值等。這樣，染色的固定樣品的成像就可以充分利用相機的全部動態(tài)設定。因此，固定成像可以得到理想的信噪比。但不幸的是，由于細胞活性對照明的嚴格要求，活細胞成像的情況又與固定細胞的成像有所不同。在活細胞成像時，樣品的灰度往往比背景高不了多少。在這種情況下，成像首要考慮的是檢測系統(tǒng)的暗電流及噪音值。經(jīng)濟型的相機通常噪音都會比較高，導致背景混亂并掩蓋樣品信號，在讀出速率增加時這種影響更為嚴重。所以，幾乎所有的活細胞成像設備質量的衡量標準都是檢測器的好壞。

數(shù)字圖像的噪音主要由四方面造成，檢測器，照明系統(tǒng)，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的隨機性造成），以及彌散光。在大多數(shù)情況下，通過選擇好的檢測器或優(yōu)化照明條件可以降低系統(tǒng)噪音。事實上，任何一種光子檢測器在記錄的時候都會產(chǎn)生某種形式上的噪音。掃描光聚焦及多光子顯微鏡中的光電倍增管（PMT）會產(chǎn)生雜電子。同樣的，用于明場，全內(nèi)反射，針孔碟片共聚焦，場掃描顯微鏡的CCD也會生成背景暗電流。對此，CCD 及光電倍增設備也做了一系列的改進，比如制冷設備，它會使儀器工作時保持在低溫狀態(tài)，從而降低暗電流的水平。然而，在讀取光信號并將模擬信號轉換為數(shù)字信號的時候，特別是CCD這種儀器，也會產(chǎn)生噪音，即read noise，制冷數(shù)碼相機產(chǎn)生的主要噪音。

                                                                       

                             

Figure 2所示為影響活細胞成像質量的數(shù)字相機的讀出速度與敏感度的相互依存關系。The specimen is a culture of human 圖中樣品為人的宮頸癌細胞（HeLa 細胞系），展示mKO（monomeric Kusabira Orange）熒光蛋白與人的α珠蛋白融合，圖片在寬視場熒光下單色相機拍攝，照明中添加TRITC濾片，讀出速度為10或1.25 MHz。Figures 2（a） & 2（b）所示，在關閉CCD 光閘的條件下，低讀出速度下的噪音要明顯高于高讀出速度下的噪音。但是，如果將CCD 調(diào)節(jié)到全動態(tài)范圍的話，這方面的 影響就不明顯了，如Figures 2（c） & 2（d） 所示；然而，在低光照條件下，低讀出速度（Figure 2（f））的圖片質量要明顯的優(yōu)于高讀出速度（Figure 2（e）。 Figures 2（e） & 2（f） 的照明強度大約是 Figures 2（c） & 2（d） 的十分之一。如將照明強度再降低5倍效果會更加明顯，如Figures 2（g） & 2（h），低讀出速度下的圖片至少還能夠表達出需要的效果（Figure 2（h）），然而高讀出速度下的成像質量則很不理想（Figure 2（g））。

一個成功的數(shù)字成像實驗，要求樣品的空間照明模式是連續(xù)的，即整個視野內(nèi)的照明是連續(xù)一致的，每次成像間的圖片也是連續(xù)一致的。這取決于照明光源，使用鎢鹵素燈照明，樣品的光學性質在顯微鏡下通常都是連續(xù)的（被稱為光學一致性）。然而使用激光掃描顯微鏡的照明裝置對某一特定的點進行掃描，則每一次的掃描結果都不一樣。另外，使用汞燈（the mercury plasma arc-discharge lamp）作為寬視野熒光顯微鏡的照明光源，圖片結果會在光譜上體現(xiàn)為特定的分離的波長峰值。相比之下氙燈（Xenon lamps）在可見光譜下的結果就相當連續(xù)，÷但是在它在紫外區(qū)的結果不佳（這一光譜范圍通常不用于活細胞成像）。

對于金屬鹵素燈這樣的照明光源，它的特性介于汞燈與氙燈之間，也許是性能*的光源。金屬鹵素燈能夠提供從紫外到紅外間連續(xù)的光譜，此外，保有汞燈的光強。除了調(diào)整照明光源，為了達到照明一致的效果，還可以在燈箱及顯微鏡的照明輸入端口之間添加一個光導纖維（或液體光導）。在視場中的照明梯度可以通過計算來矯正（flat-field algorithms）。燈泡有時在輸出的亮度會與平均值有10％的偏離，這時需要注意的是它不能夠通過光學纖維來矯正，而要使用穩(wěn)定的電源。

對光子通量的測量是統(tǒng)計學的處理，在檢測信號時會產(chǎn)生偏差。所謂的Poisson 或 shot noise（如前所述），它體現(xiàn)在測量N個光子時，出現(xiàn)的偏差與N的平方根成正比，即信噪比。所以，增加信號光子的數(shù)量N可直接提高信噪比及圖像對比度。提高信號zui簡單的方法是手機更多的光子，通常做法是增加曝光時間或提高激發(fā)照明的強度，但是這些做法會增加光毒性并降低細胞活性。其次，另一個更有用的方法是加強檢測器的敏感度。

為了解決活細胞成像低光照的問題，現(xiàn)在的數(shù)字CCD 相機檢測器更加敏感，這是通過面元劃分（binning）來實現(xiàn)的（如Figures 3 & 8所示）。一般CCD讀取像素點會將橫向上的像素值轉移到只讀寄存器上，然后進行順序分析。在binning 處理時，相互臨近的一群光信號會被合在一起檢測（2 x 2 或 4 x 4）為一個信號值進行輸出。這通過將多行像素轉移到一系列只讀寄存器（比如兩行進行 2 x 2 binning ，四行進行4 x 4 binning）中然后多行同時讀取來實現(xiàn)的。在2 x 2 binning 情況下，空間分辨率會降低一半，信號強度增加4倍，信噪比增加2倍。很明顯，雖然降低了空間分辨率，但對于弱信號強度的提高是很顯著的。

 

 

 

Figure 3顯示的是將臨近的像素結合在一起并不斷的增加binning 水平，對數(shù)字圖像的空間分辨率及zui終尺寸的影響。樣品為印度麂鹿皮膚組織的纖維原細胞，它表達mCherry 熒光蛋白（紅色偽彩）及人的β肌動蛋白，位于應力纖維組成的絲狀細胞骨架網(wǎng)絡中。通常在進行熒光蛋白標記時，表現(xiàn)出很好的共定位的細胞常常表達很低水平的融合蛋白，其發(fā)出的信號極微弱。如果不用binning處理（Figure 3（a）），在不產(chǎn)生光毒性及光漂白的曝光時間下得到的信號弱到無法辨別。Binning 2 x 2 漸進到 4 x 4增加了信號水平，但降低了空間分辨率（Figures 3（b） and 3（c））。在binning 8 x 8 像素下的圖像（Figure 3（d））zui亮。但分辨率降低極多。另外很重的一點是，在binning 處理時，增加合并像素點，圖像尺寸按比例縮小例如，不進行binning 處理（1 x 1）的圖像（Figure 3）的原始大小為1360 x 1024 （pixels），在（2 x 2）, （4 x 4）, 及 （8 x 8） 處理條件下的圖像分辨率分別為680 x 512, 340 x 256, 及 170 x 128 （pixels）。如上所述，這些圖像的尺寸被縮小了。同樣的，一個512 x 512 的數(shù)碼相機在進行上述比例處理時，圖像的大小將分別縮小為256 x 256, 128 x 128, and 64 x 64 （pixels）。

Binning 處理的重點是讀出噪音產(chǎn)生在binning 處理后，所以雖然讀取了幾個像素的集合，但是每個binning處理后的像素只讀取一次。相對的，像 2 x 2 這樣的像素集合，如果先收集信號再進行平均計算，那么由于每個點都會產(chǎn)生噪音，這樣的結果會比binning差。因此，雖然binning處理會降低空間分辨率，但是這樣的處理可以顯著提高空間分辨率，這在光敏細胞的試驗中是非常有意義的，因為在這樣的試驗中，光照水平非常的低，而且曝光時間和很短。在活細胞成像中zui重要的參數(shù)通常是檢測若熒光信號的能力，而不是空間分辨率，所以，通過binning 處理提高敏感度及縮短曝光時間是成像的重點，不需太多考慮空間分辨率。除binning 處理外，許多相機通過小范圍拍攝或只拍攝感性的區(qū)域來縮短曝光時間，這種拍攝方法可以在保有空間分辨率的同時減少曝光對細胞的損害。

克服常規(guī)相機的缺點

 

為了滿足極低照明下高速成像的需求，開發(fā)商們推出了一種有效的放大弱信號的相機，EMCCD。這種EMCCD 通過芯片上益增寄存器進行信號放大，敏感度能夠達到單光子檢測級別，同時不會像傳統(tǒng)CCD 一樣降低量子效率和空間分辨率。EMCCD 的一個顯著特性是，通過芯片上專門的外延串行寄存器，在硅亞結構內(nèi)發(fā)生碰撞電離過程中進行增益。（Figure 4）. 由光子激發(fā)出的電荷要高于讀出噪音，這即使在高幀頻下也能實現(xiàn)，并且對于現(xiàn)在的任何CCD 都使用，包括背照芯片CCD（back-illuminated CCD）。

 

 

 

EMCCD 的優(yōu)越性在于由于放大過程直接發(fā)生在CCD 的結構內(nèi)，它要比其它的強化CCD（intensified CCDs）便宜一些。對于單分子成像，全內(nèi)反射，針孔碟片場掃描共聚焦離子通量檢測實時3D試驗等弱信號的測定，EMCDD 要比其它針對弱光的感光原件好很多。另外，如果使用傳統(tǒng)的熒光成像技術，EMCCD極高的敏感性可以在弱光及/或低激發(fā)強度下得到高信號強度，這樣，可以降低光毒性及熒光的光漂白。

顯微鏡的光學系統(tǒng)

用于活細胞成像的顯微鏡的結構必需足夠堅固，或者是鋁制的，同時，也要足夠穩(wěn)固防震。而顯微鏡外露的光學表面及聚光鏡，燈箱，物鏡轉盤等裝置必需保持潔凈，存放顯微鏡的房間要保持低濕度的無塵狀態(tài)。在活細胞成像的日常使用時，必需保證所有的光學通路及光圈在同一軸線上，并應用克勒照明。存放顯微鏡的房間也有相應要求，室內(nèi)不要安裝頂燈，以減少直接進入目鏡及樣品處的光線。

電子數(shù)字相機通常通過專用的接口接在顯微鏡的一個或幾個相機接口上。研究級的顯微鏡通常有多個接口同時連接幾個相機（如 Figure 1）。這對于需要使用不同手段得到*圖像效果的顯微成像是十分有用的。在顯微鏡機身內(nèi)部有一系列反光鏡，分光鏡，棱鏡分別被安置在恰當的位置以將光信號反射到不同的相機接口及目鏡中。需要注意的是，由于部分光進目鏡而減少了進入相機接口的光線，相機成像的信噪比會降低。因此，在配置顯微鏡時，應該將若熒光照相的分光口的分光率設置為100％。

物鏡負責收集由樣品發(fā)出的光線，并將其傳到顯微鏡的光學組件中，因此，物鏡的選擇是至關重要的。在光路中的光學組件，如反光鏡，分光鏡，聚光透鏡，濾光鏡，棱鏡等會嚴重的降低信噪比，所以，這種效應必需降低。在熒光成像時，應當使用高數(shù)值孔徑的物鏡，因為它能夠盡可能多的收集由樣品發(fā)射出的光線。數(shù)值孔徑（Numerical aperture）體現(xiàn)了其棱鏡能夠從單一點光源收集光線的能力，因此，對于活細胞成像，數(shù)值孔徑是zui重要的考慮因素。其數(shù)值標注在物鏡筒上，大小從0.25（低放大倍數(shù)，如10x干鏡）到1.20（水鏡）及1.45（油鏡，40x - 100x范圍）不等。數(shù)值孔徑的數(shù)學表達式如下：

Numerical Aperture （數(shù)值孔徑，NA） = Refractive Index （折射率，η） × Lens Acceptance Angle （鏡口角的正弦值，sin（θ））

因此，物鏡對光的收集能力與物鏡前透鏡及樣品間介質的折射率有關，與鏡口角的正弦值有關。數(shù)值孔徑為物鏡分辨率數(shù)學表達式的一個因數(shù)。根據(jù)瑞利判據(jù)（Rayleigh criterion，一種保守的估計），分辨率等于照明光波長與一個常數(shù)（1.61）的乘積與數(shù)值孔徑的商。另外，數(shù)值孔徑還決定了圖像的亮度，圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比，與放大倍數(shù)的二次方成反比。所以，稍微提高數(shù)值孔徑都能夠顯著地提高信號強度。因此活細胞成像要求使用數(shù)值孔徑zui高的物鏡及高折射率的浸入物（油或水）。

如上，圖像的亮度與物鏡放大倍數(shù)的二次方成反比，因此弱信號成像使用低倍數(shù)的物鏡。比如說，在100x數(shù)值孔徑1.4的物鏡下觀察樣品，如果這個時候信噪比成為影響圖片質量的主要因素，那么將物鏡轉換到60x或40x，則同樣的數(shù)值孔徑下圖片的亮度會得到顯著的提高。事實上，將60x/1.4與100x/1.4的物鏡進行對比，對同一張熒光圖像成像，前者要比后者亮三倍。觀測強度也是衡量物鏡透光能力的一個因素。在某些試驗中，為了達到要求的放大率，通常要將放大與binning 處理借個起來。

在多重標記的固定細胞試驗中（有時也能是活細胞試驗），具有色差及平場矯正的物鏡是的。然而不幸的是，復消色差物鏡和平場復消色差物鏡中相對于消色差物鏡和螢石物鏡（低度物鏡）來說，不可避免的添加了很多光學器件（透鏡）。高矯正的物鏡不會生成假象，可應用于透射光技術，如相差，DIC等。然而，矯正的結果降低了光透過率，這對固定細胞的成像不會有很大的影響，但是對活細胞成像來說卻不然。闡述這種現(xiàn)象的例子是，一個40x/1.4的平場復消色差的物鏡，理論上要比同類100x物鏡亮六倍，但實際上，前者的亮度只有后者的四倍左右。但無論如何，40x及60x的物鏡在光學分辨率極限下，仍能提供zui亮的圖片。

 

 

 

如Figure 5 所示，為就圖像分辨率及亮度方面，物鏡數(shù)值孔徑的重要性。樣品為非洲綠猴的腎臟上皮細胞培養(yǎng)物 （CV-1 line），用表達特異結合線粒體的EGFP 的質粒轉染該培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下可以觀測到線粒體在細胞中的網(wǎng)絡分布。

Figure 5 為平場螢石物鏡下相同視野的圖片（數(shù)值孔徑1.3，放大倍數(shù)由40x到100x不等）。雖然圖中的拍攝條件及矯正手段相同，但40x下的線粒體要比其它條件的亮（Figure 5（a），圖片大小為經(jīng)調(diào)整）。相比之下，60x及100x下的圖片逐漸變暗，100x下的線粒體幾乎不可見 （Figures 5（b） & 5（c））.這樣的物鏡仍然可用，但是必需放大檢測器的增益值，這樣一來信噪比就會降低，圖片質量也相應下降。 需要注意的是，由于數(shù)值孔徑相同，從Figures 5（d）到5（f）的分辨率是一樣的。

    以上的例子說明在選擇活細胞成像的物鏡時，如果樣品標記熒光，則不要盲目的追求放大倍數(shù)。對共聚焦顯微鏡的40x或60x物鏡來說來說，在成像時進行放大后的結果和100x物鏡的成像效果相同（Figures 5（d） and 5（e））。由于具有相同的數(shù)值孔徑，兩個物鏡的分辨率是一樣的。但這種說法并不是說60x或100x 的物鏡沒有任何作用。事實上，觀察小樣品通常要使用高倍數(shù)的物鏡，比如寬視場顯微鏡下觀察過氧化物酶體和分泌顆粒。由于圖像大小通常與檢測器的尺寸有關，所以，光學成像zui終的放大率取決于CCD的參數(shù)（像素點大小，中間變倍等）。因此，物鏡的選擇通常要考慮光學顯微鏡的配置，以及試驗的特殊要求。

信噪比比分辨率的影響更大的時候，要選擇矯正度低的物鏡，這樣的物鏡中光學原件更少，相對的光的透過率會顯著提高。同樣的，相差物鏡中的光學器件也會減少光的透過率。這種水平的減少在透射光成像時不會有影響，但是在熒光成像時大概會減少15 %-20％的光透率。因此，在進行活細胞成像時，如果試驗用的熒光標記較弱，則不能用相差物鏡，除非實驗步驟方面有特殊的要求。同樣的，當試驗要求將熒光圖片同DIC圖片進行疊加時，在熒光成像前要將物鏡下方的偏光裝置拿開，因為它大概會減少30％ 的透光率。

    光路中的任何缺陷都會直接影響zui終成像的信噪比。對于活細胞成像來說必需消除高數(shù)值孔徑物鏡的球差。通常引起球差的因素有培養(yǎng)液及物鏡浸入物等。球差是由于光沿光軸不均勻分布造成的，會導致成像變形。由于成像樣品通常較大，球差還會影響信噪比。這個問題在對厚組織成像時要比薄層細胞成像時嚴重很多，由于水的折射率與培養(yǎng)基的折射率接近，通常使用水鏡來消除這個問題。另外一種方法是矯正因培養(yǎng)基或蓋玻片導致的折射率的改變。由于折射率會受溫度影響發(fā)生變化，所以，在室溫下與在37攝氏度下的浸入物及蓋玻片厚度需要做適當調(diào)整。的物鏡可通過矯正環(huán)來消除溫度引起的折射率的改變。

 

 

 

如 Figure 6 所示，為顯微鏡光學系統(tǒng)（a）及數(shù)碼相機檢測系統(tǒng)（b）對活細胞成像的影響。圖中樣品為鼠袋鼠腎臟的一個上皮細胞（PtK2 line），該細胞表達EGFP，EGFP與H2B組蛋白結合定位于細胞核。觀察方法為寬視場落射熒光。如圖，左圖右下方及右圖左下方為分辨率*的兩張。在活細胞顯微成像方面，光學系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑及光源的波長決定了圖像對比度與物理分辨率。在左圖中，隨著照明強度的增加，圖像中的噪音明顯減少；隨著光學分辨率的提高，細胞核中的細節(jié)變得更加清晰。

在右圖中，圖像質量隨著灰度及空間分辨率改變。增大像素尺寸，圖像的細節(jié)變得模糊不清，圖像幾乎無法辨認；而降低灰度，會改變圖像外形，并僅呈現(xiàn)出具有高對比度的信息。以上兩種因素共同改變圖像質量，同樣，在活細胞成像試驗中以上因素需要根據(jù)試驗需要進行配置。

在活細胞成像試驗中還應用了各種濾色片及反光鏡，它們的作用是調(diào)整從照明器經(jīng)顯微鏡到檢測器中光的波長。在透射光系統(tǒng)中這些增稱光學組件包括起偏器，棱鏡（DIC），聚光鏡環(huán)，相差環(huán)等。在透射光成像系統(tǒng)中，如明視野，DIC，相差等，光的強度要比熒光大得多，所以，為了提高信噪比，需要在光路中添加一些組件。其中首要考慮的是過濾金屬鹵素燈的紫外及紅外波段的光以保護樣品。紅外線產(chǎn)生的熱效應會損害細胞活性，并會降低紅外敏感CCD 成像的信噪比。紫外線很少出現(xiàn)在透射光源中，為了阻止這些波長范圍的光，只需添加綠光片或紅光片即可。紅外及可見光濾光片都會顯著降低光強，所以在成像時需要增加曝光時間及增益以保證適宜的信噪比。

在熒光成像中，為了保證激發(fā)光及發(fā)射光的波長在適宜的范圍內(nèi)，會在光路中添加濾光片及半透半反濾光片。在相對光強較低的熒光成像中，選擇濾光片首要考慮的是它是否能提供適宜的信噪比。大多數(shù)情況下，光會不分波長大量的通過光學組件以至于掩蓋了熒光染料發(fā)出的信號，這時帶通濾色片就顯得非常重要。通常這中窄波段的濾色片會限制絕大部分光透過，所以，為了得到滿意的圖片，研究人員必需選擇適宜帶寬的濾色片。

現(xiàn)在，市場上有很多廠商提供特制的帶通濾色片及半透半反濾色片組合。在為活細胞成像選擇濾片組時，為了得到好的信噪比，所選的組合要zui接近熒光子的光譜性質。例如，選擇標準的多色熒光成像FITC 濾色片組專門為進行YFP成像時，就不需要為了提高信噪比而濾掉部分YFP 范圍內(nèi)的光（Figure 7（a））。在這種情況下，選擇符合YFP 吸收及發(fā)射波段的帶通激發(fā)光濾色片及長通發(fā)射光濾色片會得到*的效果。

 

 

 

再舉一個兩個熒光蛋白衍生物波段的選擇實例（Figure 7）。圖中上部為YFP 的變種Venus 的激發(fā)及吸收光譜，它配合FITC 濾片組及寬波段發(fā)射光光譜以達到的信號收集效果。發(fā)射光濾色片的選擇與檢測器收集的信號直接相關，而上述組合顯然不如寬帶通YFP 組和收集的信號多。 同樣的，TRITC 濾片組（Figure 7（c））在mCherry 熒光蛋白的激發(fā)波段不如Texas Red 濾片組（Figure 7（d））效率高。另外，Texas Red 濾片組的發(fā)射光波段更寬，允許檢測器收集更多的信號。所以，在為活細胞成像選擇熒光基團時需要配合濾片組合一起考慮，以保證得到*的激發(fā)及發(fā)射信號。

現(xiàn)在有更多的帶寬組合可供多色熒光標記同時成像。另外還需要考慮的是在顯微鏡光學組件中添加中性密度濾色片來降低激發(fā)及發(fā)射強度——這在活細胞成像中是重要的，如同阻擋或減少紫外，紅外線的細胞光毒性。這些濾色片通常放在顯微鏡光源接口處，并可以隨時取出以增加光強。通過顯微鏡的光強及數(shù)值孔徑可以通過聚光鏡或落射照明器的孔徑光闌及視場光闌進行調(diào)節(jié)。

 

檢測器幾何形狀與光學分辨率間的匹配

由于樣品有檢測器成像，圖像的空間分辨率取決于光學系統(tǒng)的分辨率。因為CCD 的檢測器有一列光電二極管組成，每個都有固定的尺寸，所以，每個像素的幾何學特性限制了圖像的zui終的分辨率。為了達到顯微鏡的分辨率，檢測器的尺寸要符合Nyquist 抽樣標準——2.5-3 pixels/Airy disk unit。舉個例子，對于光學分辨極限250 nm，圖像zui終的像素大小應接近80-100 nm。對活細胞成像來說，信噪比要比空間分辨率更重要，所以*的成像方式為2 pixels/Airy disk，這種方式不會對圖像質量造成明顯損害。降低每個像素與Airy Unit的比例會增加圖像的亮度，并且可以使用更大的CCD 光電二極管，以累積更多的光電子。

Figure 8（a） 中描述的是應用高數(shù)值孔徑物鏡進行活細胞成像時Airy disk 與CCD 像素列陣的投射關系。列陣中每個像素大小為6μm。100x/N.A.1.4 的物鏡投影在CCD表面上的像直徑為20μm（Table 1），因此，可以達到Nyquist 抽樣標準（3.3 pixels/Airy unit）。在這樣的采樣頻率下，有充足的空白可以進行2x2 的binning 處理。相對的相同數(shù)值孔徑下60x 物鏡的投影直徑為12 μm，剛好低于Nyquist 的下限。另外，即使將數(shù)值孔徑降到1.3，40x 物鏡投影直徑仍只有8.4μm ，需要連接放大接口才能達到Nyquist 分辨率標準。光電二極管列陣的像素尺寸可大可小以匹配顯微鏡的空間分辨率，而無需添加中間變倍體；或者可以配置一個特制的CCD 接口，這樣的接口中包含了一系列棱鏡系統(tǒng)。

Figure 8（b） 中顯示的為2x2 binning處理的原理圖，列陣中包含16個像素。曝光后，CCD 收集的光電子將進行兩次平行遷移，然后，串行寄存器上發(fā)生兩次遷移，這樣一個像素上將收集4個像素（2x2 binning）的光電子，并將其傳輸?shù)捷敵龉?jié)點進行放大。4x4 binning 的處理方式與此相同，在處理過程中收集列陣中16 個像素信號并在輸出前進行放大，這樣一來可以顯著地增強信號，同時降低讀出噪音。如前面討論過的，binning 處理是活細胞成像中一個的弱信號收集方式，這種處理可以降低對低熒光表達量細胞的毒害。

 

 

 

 

實際上，由1.4數(shù)值孔徑的物鏡成的像，zui終大小介于100-120 nm 之間。將這樣大小的信號一合適的物理尺寸轉移到CCD 光電二極管中，需要考慮物鏡的放大倍數(shù)。例如，要達到60x/1.4 物鏡的zui大分辨率，光電二極管不能大于6μm ——大小取決于放大倍數(shù)及分辨率。然而，對100x/1.4 的物鏡來說，光電二極管zui大可至10μm。因此可以很明顯的看出，只有當CCD 的配合了適當?shù)奈镧R，數(shù)字分辨率才會與光學分辨率相匹配。10μm光電二極管與100x 物鏡組合生成的圖片像素大小為100 nm；當與60x 物鏡組合時生成的像素大小為167 nm，這時；圖片的分辨率會低一些。相比之下，6μm 光電二極管與60x 的物鏡配合則是*的，但是當與100x物鏡組合時，則會取樣過度。這種情況下的取樣過度會降低圖像亮度，從而無法改善圖像分辨率。

從前面的討論看來，似乎想要得到理想的分辨率就得為不同的物鏡配不同的CCD。實際上，這種方法一點都不實際，所以，需要找到一個折衷的辦法。在有些情況下，這個問題可以通過在CCD 與顯微鏡之間添加一個耦合器來消除物鏡放大倍數(shù)造成的影響。例如，0.6x 的接口可以將100x 物鏡的投影大小降低到60x 物鏡的效果。通過售后經(jīng)銷商可以得到各種耦合器，可放大或縮小CCD 光電二極管上投影的大小。以上的建議中需要注意的是，這些組件添加或移除相對來說非常容易，不要把CCD 從顯微鏡接口處拿下來，以防灰塵或顆粒進入顯微鏡機體內(nèi)或相機成像傳感器上。清潔傳感器是件非常困難的事，尤其是要*清除那上面的每一個灰塵及顆粒。

 

與顯微鏡光學分辨率相匹配的像素大小

 

Table 1

現(xiàn)在許多為熒光顯微鏡設計的CCD 的光電二極管大小在5-16μm 范圍內(nèi)，并可進行binning 處理。如上討論，通過binning 處理，幾個光電二極管上的信息倍整合到一個單元中，從而有效的增大像素尺寸。6-8μm 大小的光電二極管可匹配60x 的物鏡，經(jīng)過2x2 binning 處理，可匹配100x 物鏡。這中情況下，使用高透過性的物鏡，可使100x 物鏡下成像更加明亮。這樣，100x 物鏡下，bin 2 下的圖片幾乎是60x 物鏡下，bin 1 圖片亮度的二倍，而分辨率近似或高于bin 1。當要求更高的敏感度時，使用60x 物鏡進行2x2 binning 處理可以增加圖像亮度，這時對于活細胞成像來說，分辨率上的損失在可接受范圍內(nèi)。

在一些實驗中，例如大群細胞的同時成像，獲得視野內(nèi)更多的信息要比空間分辨率重要。在沒有中間變倍體的情況下，CCD 的矩形傳感器無法獲取目鏡視野內(nèi)所有的信息，通常只有30-80% 左右，大小取決于芯片尺寸。如果要獲取更大的圖片，需要添加一個具縮小功能的耦合器（如前所述）。通常0.6x的透鏡就可以使整個視野內(nèi)的圖片投影到芯片上，但同時會降低一些分辨率。如果要保有圖像分辨率，可以通過x-y 掃描獲取多張圖片然后用軟件進行拼接。

光學顯微鏡上使用近紫外光源來獲得zui高分辨率。近紫外后，分辨力的順序是藍，綠，紅。在大多數(shù)情況下，研究人員使用金屬鹵素燈產(chǎn)生的寬光譜進行照明，但是在活細胞成像中，照明光譜通常被濾色片控制在很窄的波段?？梢姽庾V中部波長大約為550 nm，人眼zui敏感的綠色。Table 1 中的分辨率就是在這個波長下測定的。所以在不同波長下，這些值是不同的。數(shù)值孔徑也是重要因素，如表中所列，放大倍數(shù)相同的條件下，數(shù)值孔徑越高，分辨率越高。

 

總結

也許在活細胞成像中zui關鍵的就是在獲得zui高光學分辨率的同時平衡試驗中信號強度（降低放大倍數(shù)），分辨率（提高放大倍數(shù)）及細胞活性間的關系。研究人員還必需選擇盡量少的透鏡來配合光學放大及檢測器像素尺寸。配合不同物鏡（放大倍數(shù)及數(shù)值孔徑）的各種類型的中間變倍體都可以購買得到，以滿足弱光及高分辨率試驗的要求。在選擇物鏡放大倍數(shù)時，必需嚴格遵守Nyquist 分辨率標準。每個像素不得大于分辨率極限的一半；由于顯微鏡中衍射極限，工作距離通常不能小于50 nm。

活細胞成像用標準物鏡通常為10x 及40x 干鏡，及40x， 60x，100x 油鏡或水鏡。經(jīng)濟的低放大倍數(shù)的干鏡通常用來進行初步檢測，比如找到細胞的位置，因此過高不需要光學矯正。然而浸潤鏡頭則需要高數(shù)值孔徑（油鏡1.3-1,4，水鏡1.2），及高光透過性。由于圖片采集與視場中部，多以高平常物鏡并沒有多大意義，而同時這樣的物鏡昂貴并且光透性比其它物鏡低。所有用于熒光成像的物鏡都需要用熒光珠檢驗其點擴散函數(shù)。

無論落射熒光還是透射光（DIC 及相差），單色冷CCD 是成像的*選擇，這包括培養(yǎng)中的活細胞。在選擇相機時需要考慮的是量子效率，噪音水平（暗電流及讀出噪音），像素大?。皾M肼容量），及掃描頻率。為了減少光對樣品的損害，當選擇高敏感度的相機，即高量子效率，低噪音，大像素尺寸，和低掃描頻率。因此，敏感度還需與分辨率（高分辨率，低像素尺寸）及顯像率（高掃描頻率）之間平衡。

低掃描CCD 的幀速率通常不高，因此，除非樣品的亮度*，在低曝光條件下信噪比會很低。這些因素都限制了CCD 在高速成像中的應用（30幀/s），并是樣品成像變得令人挫敗。另外還需避免光漂白及光毒性，一些產(chǎn)品在拍攝時可以在細胞活性與亮度之間取得平衡。處于以上考慮，相機應無光閘，具幀轉移或插值傳感器，這樣除了低速數(shù)字信號掃描外，可以持續(xù)地在錄像速率下拍攝圖像。在熒光探針亮度很低或量子產(chǎn)量很低等極弱光條件下，如果要求高速成像，可選擇增益型或電子擴增型CCD。