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膜蛋白研究的整體解決方案
點(diǎn)擊次數(shù)：1314 發(fā)布時(shí)間：2009-10-12
提起膜蛋白，浮現(xiàn)在廣大從事蛋白研究的科研工作者腦海中的是兩點(diǎn)：1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困難性。
*，膜蛋白在細(xì)胞間接觸、表面識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和運(yùn)輸方面都扮演著重要的角色。由于它們功能多樣，也就成為理想的藥物靶點(diǎn)。然而，膜蛋白的生化和結(jié)構(gòu)研究一直都很緩慢。Protein Database的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在成功解析出三維結(jié)構(gòu)的蛋白中，膜蛋白只占1%，這與膜蛋白占總蛋白的1/3的總量的差別巨大。由此也可以看出膜蛋白研究確實(shí)困難重重。
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| 圖 1. 利用QIAgenes優(yōu)化序列，昆蟲細(xì)胞體外進(jìn)行膜蛋白表達(dá)。 |
QIAgenes Expression Kit預(yù)制蛋白表達(dá)載體，可以幫你克服蛋白（包括膜蛋白）表達(dá)的難題。該預(yù)制表達(dá)載體采用的GeneOptimizer軟件，對DNA序列進(jìn)行以下方面的優(yōu)化：稀有密碼子，GC含量，ARG位點(diǎn)，可變剪切點(diǎn)，mRNA二級結(jié)構(gòu)等因素進(jìn)行優(yōu)化，確保優(yōu)化后的序列能在E.coli的體內(nèi)，體外，真核細(xì)胞的體內(nèi)或體外，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
成功表達(dá)了膜蛋白，接下來的挑戰(zhàn)就是怎么分離出表達(dá)的膜蛋白。與可溶性蛋白不同，膜蛋白具有單重或多重跨膜結(jié)構(gòu)容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致膜蛋白很難溶解。目前常用的方法就是去污劑進(jìn)行膜蛋白的溶解。去污劑同時(shí)具有疏水和親水區(qū)域，和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污劑的復(fù)合物，從而可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化。但是這里必須要指出的是，由于膜蛋白的種類不同，適合其溶解的去污劑類型也不一樣，這就需要在溶解膜蛋白是篩選一系列的去污劑以獲得*的溶解效果。為了從事膜蛋白研究工作者的寶貴時(shí)間，QIAGEN推出了Ni-NTA Membrane Protein Kit，專門用于帶有His標(biāo)簽的重組膜蛋白的溶解和后續(xù)純化。
Ni-NTA Membrane Protein Kit有兩部分組成，一部分是膜蛋白的溶解試劑，該部分包括7種zui常用的去污劑，用于供客戶篩選自己的去污劑；另一部分是Ni-NTA純化試劑，用于在膜蛋白溶解用，利用His標(biāo)簽和Ni-NTA的親和特性進(jìn)行進(jìn)一步純化。該試劑盒zui大的優(yōu)勢在于幫助膜蛋白研究者在zui短的時(shí)間篩選得到*的去污劑，并且進(jìn)行Ni-NTA純化獲得純度高的膜蛋白。
圖 2. 利用QIAGEN Ni-NTA membrane Kit篩選NhaA 的去污劑類型。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OG和NG不適合該膜蛋白的溶解，可以選擇DM， LDA0， DDM Cy6， 和FOS 進(jìn)行NhaA溶解. M： His-tagged marker proteins。
圖 3. 選擇DDM進(jìn)行NhaA的溶解，然后利用Ni-NTA進(jìn)行純化。
TP: total protein; SF: soluble fraction; FT: flow-through fraction; W: wash fraction; E: eluate; M: markers.
在成功的純化得到膜蛋白后，如果想獲得膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)，又要面臨一個(gè)難題。據(jù)Protein DataBase 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在成功解析出結(jié)構(gòu)的蛋白中，膜蛋白只占了1%左右的比重。由此也可以看出，膜蛋白缺乏缺乏有效的結(jié)晶方法。目前常用脂立方相法建立膜蛋白的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。但是該方法存在以下局限性：1.步驟超多，建立實(shí)驗(yàn)過程非常復(fù)雜2.容易造成結(jié)晶孔間的交叉污染3.不適合高通量實(shí)驗(yàn)4.浪費(fèi)膜蛋白。為了使膜蛋白的結(jié)晶成功率提高，QIAGEN開發(fā)出了NeXtal® CubicPhase Kit。
NeXtal® CubicPhase Kit之所以能夠提高膜蛋白結(jié)晶的成功率，主要原因：1.采用NeXtal CubicPhase μplate，這種結(jié)晶板修飾了monoolein （MO，用于建立脂立方相），另外這種結(jié)晶板具有非常好的光學(xué)特性，在可見光下就可以觀測到膜蛋白晶體。2.采用專門的膜蛋白結(jié)晶溶液，QIAGEN專門開發(fā)出CubicPhase I＆II Suite用于膜蛋白結(jié)晶。 NeXtal® CubicPhase Kit非常適合高通量膜蛋白結(jié)晶。
圖4. NeXtal CubicPhase μplate結(jié)晶板，結(jié)晶孔修飾DMO。
圖5.利用eXtal CubicPhase Cystallization System成功進(jìn)行了bacterio-rhodopsin （BR） 結(jié)晶。