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細(xì)胞培養(yǎng)的一般技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：1168 發(fā)布時(shí)間：2010-3-8
促細(xì)胞分裂劑激活單核細(xì)胞
基本原理 ：
本方法是通過促細(xì)胞分裂劑與細(xì)胞表面受體相互作用，在體外觸發(fā)細(xì)胞的多克隆激活。根據(jù)所使用的促細(xì)胞分裂劑的不同，應(yīng)答細(xì)胞可以是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，或兩者同時(shí)，或者是單核細(xì)胞。 細(xì)胞激活可以通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、表面抗原表達(dá)和/或細(xì)胞體積的增加進(jìn)行檢測(cè)。例如在使用B細(xì)胞激活劑時(shí)，可以通過多克隆免疫球蛋白的分泌進(jìn)行檢測(cè)。
表1 常用的促細(xì)胞分裂劑和多克隆淋巴細(xì)胞激活劑
| 促細(xì)胞分裂劑 | 所 用 濃 度 | 應(yīng) 答 細(xì) 胞 |
| 刀豆蛋白A ConA | 1- 10 μg/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
| 植物凝集素PHA | 1-5 μg/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
| 佛波醇酯PMA | 1-10 ng/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
| 婁諾霉素+PMA | 100-500 ng/ml | T 淋巴細(xì)胞 |
| 脂多糖LPS | 2-25 μg/ml | 鼠B細(xì)胞（T不依賴型）， 單核細(xì)胞 |
| 美洲商陸PWN | 試驗(yàn)測(cè)定 | 人B細(xì)胞（T依賴型） |
| 葡萄球菌A，SAC | 1/1000-1/10000 | 人B細(xì)胞 |
試劑和設(shè)備：
l 細(xì)胞懸浮液；
l 96孔平底組織培養(yǎng)板；
l 含血清培養(yǎng)基（通常為 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）；
l 促細(xì)胞分裂劑（見表1），要求純品或半純品，有市售商品；
l 多通道移液器和微量移液器；
l 帶570nm濾片的酶標(biāo)儀；
l 超凈工作臺(tái)；
l CO2孵箱；
l 冷凍離心機(jī)。
操作步驟：
（一） 促細(xì)胞分裂劑制備
根據(jù)說明書將促細(xì)胞分裂劑重新溶解于水或培養(yǎng)液中，制成儲(chǔ)存液（如100´），保存于-20℃。
（二） 促細(xì)胞分裂劑滴定
1．在培養(yǎng)液中稀釋儲(chǔ)存液到所需的*個(gè)濃度，通常為理論*濃度的10倍；
2．在培養(yǎng)板或試管中直接將促細(xì)胞分裂劑進(jìn)行濃度遞減系列稀釋（100 μl/孔）；
3．每孔平行重復(fù)三次；
（三） 細(xì)胞激活
1． 分離外周血單核細(xì)胞；
2． 室溫下用培養(yǎng)液300´ g離心10分鐘，收集并洗滌細(xì)胞；
3． 計(jì)數(shù)細(xì)胞并將細(xì)胞在培養(yǎng)液中重新懸浮至106細(xì)胞/ml，在培養(yǎng)板中每孔加入100μl；
4． 在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育（細(xì)胞增殖需2-3天；細(xì)胞因子測(cè)定測(cè)定6小時(shí)-2天；免疫球蛋白分泌測(cè)定需5-10天）；
（四）細(xì)胞激活定量測(cè)定方法
1． 細(xì)胞增殖檢測(cè)方法采用MTT測(cè)定法；
2． 細(xì)胞因子分泌測(cè)定或使用市售商業(yè)化試劑盒；
3． 免疫球蛋白分泌測(cè)定采用ELISA檢測(cè)
對(duì)照試驗(yàn)：
1． 陰性對(duì)照：不含促細(xì)胞分裂劑的培養(yǎng)液為對(duì)照組；
2． 促細(xì)胞分裂劑沒有陽性對(duì)照。通常利用滴定曲線進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定促細(xì)胞分裂劑的*濃度以及*培養(yǎng)時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：
1． 促細(xì)胞分裂劑的計(jì)量應(yīng)答曲線通常為鐘形，并且高濃度的促細(xì)胞分裂劑其效果較差；
2． 盡量避免細(xì)胞濃度過低，不要采用圓底培養(yǎng)板；
3． 抗CD3和抗TCR抗體可以用于T淋巴細(xì)胞激活；
4． 偶聯(lián)到小珠上的抗免疫球蛋白抗體可以用于B淋巴細(xì)胞激活。
*節(jié) 細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇
基本原理：
在長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能會(huì)出現(xiàn)微生物污染或基因型改變等情況，會(huì)導(dǎo)致具有優(yōu)良特性細(xì)胞系的丟失。為防止這些細(xì)胞的丟失，細(xì)胞可以經(jīng)快速冷凍并幾乎無限期保存在非常低的溫度下，如液氮（-176℃）。
試劑和設(shè)備：
l 冷凍液: 90%滅活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存；
l 培養(yǎng)液；
l 臺(tái)盼藍(lán)溶液（0.4%溶解于PBS）；
l 70%乙醇；
l 組織培養(yǎng)瓶；
l 15-50 ml 無菌圓錐底離心試管；
l 離心機(jī)；
l 血球計(jì)數(shù)板；
l 超凈工作臺(tái)；
l 光學(xué)顯微鏡；
l 37℃水?。?o:p>
l 冷凍管；
l -80℃冰箱；
l 液氮和液氮容器。
操作步驟：
（一）冷凍細(xì)胞
1． 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；
2． 以25μl臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25μl細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（至少應(yīng)該在90%以上）；
3． 細(xì)胞懸液在4℃ 條件下200´g離心10分鐘；
4． 將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5´106細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液）；
5． 將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；
6． 將冷凍管置于-80℃冰箱中；
7． 24小時(shí)后，將冷凍管移入液氮罐中；
8． 在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。
（二）細(xì)胞復(fù)蘇
1． 將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時(shí)攪拌加速解凍；
2． 當(dāng)細(xì)胞*解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；
3． 將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含4℃預(yù)平衡培養(yǎng)液的試管中；
4． 細(xì)胞懸液在4℃下200´g離心10分鐘；
5． 棄上清，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中；
6． 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱中培養(yǎng)；
7． 是用倒置顯微鏡檢查細(xì)胞存活率以及細(xì)胞密度，如果細(xì)胞密度過高，用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。
對(duì)照試驗(yàn)
在冷凍細(xì)胞被移入到液氮罐中一段時(shí)間后，取出一管細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行培養(yǎng)以檢測(cè)存活率。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：
1． 嚴(yán)格遵守液氮操作規(guī)則（即戴上合適的手套和護(hù)目鏡），液態(tài)氮對(duì)眼睛極為有害；
2． 對(duì)一瓶細(xì)胞培養(yǎng)液要盡可能多分裝幾個(gè)冷凍管；
3． 延長(zhǎng)暴露在DMSO中的時(shí)間對(duì)細(xì)胞有害，因此冷凍和解凍操作要盡可能快；
4． 細(xì)胞可以暫時(shí)穩(wěn)定保存在-80 ℃達(dá)數(shù)月；
5． 每批次冷凍和復(fù)蘇的細(xì)胞的存活率可能會(huì)不相同，為避免這個(gè)問題，每次細(xì)胞凍存分兩批以上進(jìn)行；
6． DMSO可以防止在細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)冰結(jié)晶，凍存過程需要逐步降低溫度；
7． 如果復(fù)蘇后細(xì)胞難以恢復(fù)到良好狀態(tài)，可以使用含10%鼠胚胎成纖維母細(xì)胞培養(yǎng)上清的培養(yǎng)液以促進(jìn)恢復(fù)；
8． 也可以用含20%熱滅活胎牛血清和10%DMSO的培養(yǎng)液為冷凍液。
第二節(jié) 支持物培養(yǎng)法培養(yǎng)貼壁細(xì)胞
基本原理：
通過在支持物（如蓋玻片）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，可以應(yīng)用抗體檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)或進(jìn)行酶細(xì)胞化學(xué)以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞貼壁牢固，能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)的狀態(tài)。
試劑和設(shè)備
l 細(xì)胞懸浮液；
l 6孔平底組織培養(yǎng)板，或φ60 mm培養(yǎng)皿；
l 18mm x 18mm 或20mm x 20mm浸于75%乙醇中的蓋玻片；
l 含血清培養(yǎng)基（通常為 RMPI 1640,含10% 小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）；
l 超凈工作臺(tái)；
l CO2孵箱；
l 蓋片鑷；
操作步驟：
1． 用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；
2． 將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；
3． 在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；
4． 將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；
5． 將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明
1． 本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；
2． 所使用的蓋玻片應(yīng)該為玻璃制造，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；
3． 蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；
4． 如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；
5． 如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。