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一般生物體是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)
?        經(jīng)過特殊的手段，減少體積和厚度，使光線能透過。
?        基本原則：保持其原有的組織結(jié)構(gòu)和相互關(guān)系。
        制片方法的種類
?        切片法
        石蠟切片法、冰凍切片法等
        優(yōu)點(diǎn)：組織間的各種構(gòu)造能保持正常的相互關(guān)系
        缺點(diǎn)：切成薄片，不能看到完整的組織
?        非切片法
        整體封藏法：單胞藻、雞胚、菌類等
        涂片法：血涂片
        壓碎法：染色體
        優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，保持每個(gè)單位（組織）完整
        缺點(diǎn)：由于受到壓迫等，組成部分的正常位置關(guān)系有所變動(dòng)
        切片法的主要步驟（石蠟切片法）
?        取材
?        固定
?        沖洗、脫水與透明
?        透入與包埋
?        切片與貼片
?        染色
?        封片與觀察

取材
        活體取材
?        材料的新鮮：動(dòng)物體死亡后，會(huì)產(chǎn)生一些變化（自溶）
?        動(dòng)物殺死的方法：避免使動(dòng)物長時(shí)間陷于痛苦和瀕于死亡的狀態(tài)，以免使動(dòng)物的組織細(xì)胞成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，或引起病理假象。
        取材的要領(lǐng)
?        迅速：減少組織細(xì)胞的死后變化
        實(shí)驗(yàn)前對所取組織的結(jié)構(gòu)、部位有明確的了解
        熟練
?        避免機(jī)械損傷：細(xì)胞、組織的變形
?        組織塊大小適中：與固定液有關(guān)
        一般厚2~5毫米，長、寬不超過1.5X1.5毫米
?        保持材料的清潔
        用生理鹽水沖洗組織塊上的血液、污物和黏液等
?        總之：盡量保持所取組織塊在自然狀態(tài)下的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。
固定與固定液
        固定的目的
?        迅速阻止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶與*
?        使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖等成分變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其原有狀態(tài)
?        使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，以便染色后易于鑒別和觀察
?        使組織塊硬化，便于制作薄片，并在以后的過程中不易損壞
?        使不同的組織成分對染料有不同的親和力
        固定的對象
?        主要是蛋白質(zhì)
        固定液的性質(zhì)
?        有強(qiáng)的滲透力，能迅速滲入組織內(nèi)部
?        不使組織過度收縮或膨脹，并使組織內(nèi)欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)
?        使組織達(dá)到一定的硬度，并獲得*的折光率、對某種染料的親和力
        固定的注意事項(xiàng)
?        組織塊不宜過大
?        固定液的量以組織塊大小的20倍為宜。
?        能使固定液從上下左右前后同時(shí)滲入組織塊
?        必須選擇滲透力強(qiáng)，又不使組織塊過度收縮和膨脹的固定液
?        固定時(shí)間的長短與材料的大小、性質(zhì)、固定液種類、性質(zhì)、滲透力強(qiáng)弱、溫度有關(guān)
        Carnoy液對組織的硬化作用強(qiáng)，不宜過長
        Bouin液一般24小時(shí)，較長也無關(guān)系
        增加溫度可縮短固定時(shí)間，但組織變化大，尤其組織化學(xué)染色不宜。
?        特殊要求的材料，需特殊的固定液
        固定液的種類
?        單純固定液
        乙醇、甲醛、升汞、乙酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、鉻酸、丙酮、三氯醋酸等
?        混合固定液
        Carnoy液
        Bouin液
        Zenker液
        酒精-甲醛液（AF液）等
        乙醇
?        還原劑
?        穿透速度快
?        固定蛋白質(zhì)效果好---不溶性物質(zhì)
        核蛋白固定后仍能溶于水
?        缺點(diǎn)
        組織容易變硬、脆
        對組織收縮大—20%左右
        能溶解脂肪、類脂、血紅素及其他色素
        避免固定線粒體、高爾基復(fù)合體
        甲醛
?        強(qiáng)還原劑
?        一般市售為37-40%的水溶液，常用的10%甲醛液，實(shí)際含量4%左右
?        滲透力強(qiáng)，固定均勻，收縮較少，硬化組織
        但經(jīng)酒精脫水、石蠟包埋時(shí)，強(qiáng)烈收縮
?        非沉淀性固定劑，對脂肪、神經(jīng)、髓鞘效果好，也可固定線粒體、高爾基復(fù)合體
?        甲醛水溶液必須無色透明，若混濁或白色膠狀沉淀—三聚甲醛，已變性
        醋酸：冰乙酸
?        能沉淀核蛋白，染色質(zhì)的固定效果好
?        穿透速度很快，一般大小的組織只需1小時(shí)
?        不能沉淀白蛋白、球蛋白（細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)）
        組織不會(huì)硬化
?        固定時(shí)可使組織膨脹
?        高濃度醋酸會(huì)破壞線粒體、高爾基復(fù)合體
        苦味酸：三硝基酚
?        強(qiáng)酸，水中溶解度0.9-1.2%
?        劇毒，能自燃、爆炸
?        沉淀蛋白質(zhì)，對脂肪、類脂無作用
?        滲透力弱，組織不硬化
?        固定后，收縮明顯—50%左右
?        固定的組織帶黃色，一般情況下不需將它除去。
        鋨酸：四氧化鋨，OsO4
?        強(qiáng)氧化劑，劇毒
?        對蛋白質(zhì)固定均勻
        不沉淀蛋白質(zhì)，而使蛋白質(zhì)凝膠化
?        可固定脂肪、類脂體，使之不溶于酒精、苯
?        穿透速度很慢，可保持組織的柔軟，可防止組織經(jīng)酒精時(shí)的繼續(xù)硬化
?        缺點(diǎn)：價(jià)格貴，固定不均勻
        表面固定過度
        深部沒有固定
        Carnoy液
?        無水乙醇：冰醋酸：氯仿=6：1：3
        無水乙醇：冰醋酸=3：1
?        穿透速度快，但固定時(shí)間不宜過長，小塊組織只需2-3小時(shí)
?        無水乙醇：固定細(xì)胞質(zhì)
?        冰醋酸：固定染色質(zhì)，防止酒精引起的組織硬化與收縮
?        適宜于細(xì)胞學(xué)的制片，尤其是染色體
        Bouin液
?        飽和苦味酸水溶液：甲醛：冰醋酸 =15：5：1
?        常用良好固定劑
?        滲透力強(qiáng)，對組織固定均勻且收縮小，染色效果好，一般組織固定12-24小時(shí)
?        苦味酸：沉淀一切蛋白質(zhì)，但穿透速度慢，使組織收縮大，使組織適當(dāng)硬化
?        冰醋酸：穿透速度快，固定染色質(zhì)，使組織膨脹
?        甲醛：穿透速度快，調(diào)節(jié)前2種試劑對組織的膨脹作用
        Zenker液
?        升汞5克，重鉻酸鉀2.5克，硫酸鈉1克，蒸餾水100毫升，冰醋酸5毫升
?        重鉻酸鉀經(jīng)醋酸酸化產(chǎn)生鉻酸
?        升汞：固定蛋白質(zhì)，但穿透力弱
?        鉻酸：固定高爾基體、線粒體、肝糖，穿透速度慢，防止升汞過度硬化組織
?        醋酸：固定染色質(zhì)，穿透速度快，減少組織被鉻酸收縮的傾向。
?        組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)常用固定劑。
沖洗、脫水和透明
        沖洗
?        材料經(jīng)固定后，從固定液中取出，洗去固定液
?        沖洗后，對組織塊可以修切，將受擠壓或不需要的部分修切、整形
?        沖洗法：
?        水洗法
?        酒精沖洗法
脫水
?        目的：祛除組織中的水分，并使組織變硬
?        材料經(jīng)固定、沖洗后，含大量水分，變軟
?        水和包埋劑不互溶
?        重要性：
?        脫水必須*，否則就會(huì)影響到透明、包埋、切片
?        脫水的方法應(yīng)逐步進(jìn)行，以防組織過度收縮而變形
?        脫水劑的特性
?        能與水按比例混合
?        高濃度：不含水
?        能與透明劑混合（或者本身就是透明劑）
        常用脫水劑
?        單純脫水劑（非石蠟溶劑）
?        乙醇
?        丙酮
?        脫水劑兼透明劑（石蠟溶劑）
?        二氧六環(huán)
?        正丁醇
?        叔丁醇
        乙醇
?        zui常用的脫水劑，可與任何比例的水混合
?        優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格低廉，操作簡便，可回收，且能硬化組織
?        缺點(diǎn)：易使組織收縮、變脆，非石蠟溶劑，不能直接用高濃度酒精脫水，必須采用一個(gè)濃度梯度
?        一般組織從70%--100%
?        柔軟組織，如胚胎組織可從30%，甚至15%開始
?        脫水時(shí)間按組織大小、種類、厚度而定
?        如厚2-3毫米，一般100%以下每級1小時(shí)左右，100%的則應(yīng)縮短
?        脫水必須在有蓋瓶子內(nèi)進(jìn)行，尤其是高濃度的時(shí)候
        注意事項(xiàng)
?        脫水時(shí)應(yīng)循序漸進(jìn)，級差不宜相差太大
?        在低濃度酒精中，每級停留時(shí)間不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體
?        在高濃度酒精中，停留時(shí)間也不宜太長，否則可使組織變脆，影響切片
?        脫水應(yīng)*、干凈，否則與二甲苯混合后會(huì)產(chǎn)生乳白色渾濁
?        如需過夜，應(yīng)停留在70%的酒精中
        丙酮
?        多用于快速脫水或固定兼脫水
?        脫水能力比酒精強(qiáng)，但對組織收縮較大
?        能使蛋白質(zhì)沉淀、組織硬化
?        不能與樹膠、石蠟混溶
        二氧六環(huán)
?        可與水、石蠟、酒精、二甲苯、樹膠混溶
?        優(yōu)點(diǎn)：
?        操作時(shí)間短，不須酒精、二甲苯，避免組織因此收縮、變脆
?        組織可在其中停留：不會(huì)使組織收縮、變脆
?        能溶解苦味酸、升汞，所以Bouin液和Zenker液固定的材料不須沖洗
?        缺點(diǎn)：
?        價(jià)格高，不能回收（易燃）
?        有毒
?        對有空隙的材料易產(chǎn)生氣泡，妨礙透蠟
        正丁醇
?        能與水、酒精、石蠟混合
?        優(yōu)點(diǎn)
?        很少引起組織收縮和變脆
?        適用于制作植物標(biāo)本
?        缺點(diǎn)
?        微溶于水，脫水能力弱
?        一般經(jīng)酒精脫水到80%再轉(zhuǎn)入，或者與酒精混合脫水。
        透明
?        二次：組織塊脫水以后、切片染色以后
?        目的
?        組織塊：便于包埋劑的透入
?        切片：有利于光線的透過，便于顯微鏡觀察
?        經(jīng)過這一步驟后，光線可以透過，組織塊呈透明或半透明狀態(tài)—透明
?        不能透明，說明脫水未盡，必須返工，而且返工后的效果不好。
?        透明劑的選擇：既能溶于脫水劑，又能溶于包埋劑，以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。
        透明劑
?        二甲苯：
?        石蠟包埋法中zui常用
?        溶于*，不溶于水，石蠟溶劑，有毒
?        透明能力強(qiáng)，但易使組織收縮，變脆
        從*—1：1—二甲苯
        在二甲苯中不宜久留，小的30分鐘，大的可適當(dāng)延長
?        如組織塊不透明，呈白色渾濁—脫水不*
?        還可用于切片透明
?        有的兼溶的脫水劑可以不用透明
?        其他的透明劑包括苯、甲苯、氯仿等
?        透明能力差，但組織的收縮、脆化小透入與包埋
        透入
?        將包埋劑透入整個(gè)組織的過程
?        石蠟切片：透蠟，用石蠟取代透明劑，滲入軟的組織使之變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，便于切片
?        透明劑—1：1—純石蠟
?        總的透蠟時(shí)間：1-1.5小時(shí)左右，溫度：40-60℃
?        注意事項(xiàng)
?        盡量保持在較低溫度中，以石蠟不凝固為度
?        盡量在zui短時(shí)間內(nèi)完成
?        否則容易引起組織變脆、收縮
        包埋
?        包埋劑：石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等
?        包埋方法
?        熔劑法：包埋時(shí)是液體，冷后為固體
?        揮發(fā)法：溶液為液體，溶劑揮發(fā)后為固體
?        雙重法
        石蠟
?        軟蠟：熔點(diǎn)為50℃以下
?        硬蠟：50-60℃
?        選擇石蠟的要點(diǎn)
?        要使石蠟硬度與組織硬度相近
?        切片較薄時(shí)（在8微米以下）用較軟的
?        室內(nèi)溫度（zui重要）
?        冬季：46-48℃
?        10-19℃時(shí)：52-54℃
?        夏季：56-58℃或更高
        注意事項(xiàng)
?        石蠟的硬度要適中
?        太硬：切片易破碎，不易成蠟帶
?        太軟：容易使蠟帶皺縮，粘貼時(shí)很難攤平
?        使用新蠟時(shí)必須經(jīng)久煮煉，因新蠟內(nèi)往往含有氣體
?        石蠟在溫箱內(nèi)經(jīng)多次熔化后，熔點(diǎn)能一再升高，可超過65℃
?        用過的廢蠟加熱過濾后仍可利用，且比新蠟好
?        新蠟或舊蠟在使用前都應(yīng)過濾1次以除去雜質(zhì)。
        透蠟的方法
?        逐步
        透蠟的要點(diǎn)
?        石蠟要*滲入細(xì)胞的每個(gè)部分，即使空泡內(nèi)也要*滲入
?        石蠟要緊密而均勻地貼在細(xì)胞內(nèi)外兩面，使組織與石蠟成為不可分離的狀態(tài)
        透蠟的時(shí)間
?        根據(jù)不同組織類型及其大小而定，與組織固定時(shí)間成正比
        包埋的方法
        可能出現(xiàn)的問題
?        脫水不夠*，有的部位特別是組織塊中心石蠟難于滲入
?        蠟塊中出現(xiàn)“蠟花”?？赡苡捎谕该鲃┪茨鼙蝗巯?置換，或者蠟本身有雜質(zhì)
?        包埋時(shí)動(dòng)作不能太慢：石蠟?zāi)?br />?        冷卻用水溫度不能過高：石蠟?zāi)烫龝?huì)產(chǎn)生結(jié)晶。所以春秋冬三季可用自來水，夏季則應(yīng)在水中加入冰塊。
切片與貼片
        石蠟切片法
?        起始于十八世紀(jì)
?        優(yōu)點(diǎn)
?        操作容易
?        可切成極薄的片（4微米左右），能制作連續(xù)切片
?        組織塊可包埋在石蠟中*保存
?        缺點(diǎn)
?        只能用于較小組織塊，較大組織不易切好，容易破碎
?        組織在脫水、透明過程中會(huì)收縮、變脆
?        制片時(shí)間太長
        火棉膠切片法
?        優(yōu)點(diǎn)
?        包埋不用二甲苯及石蠟，不經(jīng)高溫，可避免組織收縮及變脆，適用于精細(xì)材料（腦）的切片
?        火棉膠有韌性，切片不至于有折卷或破裂，適用于大塊組織、多空洞組織（腦、眼球）、硬度較高組織（骨、肌腱）
?        缺點(diǎn)
?        手續(xù)麻煩，費(fèi)時(shí)
?        切片較厚，在10微米以上
?        不能做連續(xù)切片
        冰凍切片法
?        將組織迅速凍成冰塊而切片
?        優(yōu)點(diǎn)
?        方法簡便，時(shí)間短（十分鐘左右即能制成切片）
?        組織不經(jīng)脫水、透明、包埋，所以沒有顯著的收縮，細(xì)胞形態(tài)不致有大的變化
?        不需要經(jīng)有機(jī)溶劑處理，能保存脂肪、類脂等成分
?        缺點(diǎn)
?        不能連續(xù)切片，
?        切片較厚（10微米以上），易破碎
?        染色也不及石蠟切片清晰，觀察要有一定經(jīng)驗(yàn)
?        組織塊不能過大，過大不易冰結(jié)
        切片前的處理：修塊
?        將組織周圍過多的石蠟切去，組織四周留約2毫米的邊
?        蠟塊應(yīng)修成方形或長方形
?        蠟塊的上下兩邊要求平行，否則以后切片時(shí)蠟帶會(huì)彎曲
        切片機(jī)的種類
?        旋轉(zhuǎn)式
?        滑動(dòng)式
        切片刀的傾角
?        10°以內(nèi)
?        過小:刀刃的邊緣先與蠟塊接觸
?        過大:刀口刮組織蠟塊的邊緣，切片易破碎
        切片機(jī)的轉(zhuǎn)速要均勻

切片常遇到的困難及矯正
        切片不能形成蠟帶
?        室溫過低
?        石蠟過硬、黏度不足：加蜂蠟
?        蠟邊過小
        蠟帶彎曲：蠟帶的兩側(cè)大小不等，刀不銳利
        蠟片成卷：
?        刀不 銳利、不清潔
?        刀的傾斜度過大
?        石蠟過硬
        切片出現(xiàn)皺褶
?        石蠟太軟、浸蠟不夠
?        刀鈍、傾斜度不夠
        切片厚薄不等
?        在脫水、浸蠟過程中處理不當(dāng)
?        刀鈍、切片機(jī)不佳
?        刀或組織塊未固定牢固
        組織塊中的結(jié)締組織呈不透明的白色
?        脫水不*、透明不足—影響石蠟浸透
        切片成碎卷狀
?        脫水、透明、浸蠟時(shí)間過久
?        蠟溫過高
        切片出現(xiàn)縱紋
?        刀刃有小缺口
?        石蠟不清潔
        切片出現(xiàn)橫皺紋
?        組織、刀固定不緊
        蠟塊底邊成白色
?        刀的傾斜度不足—碰撞
        切片粘刀
?        刀刃不潔、刀鈍
        蠟塊向上運(yùn)行時(shí)帶走切片
?        刀鈍
?        室溫高、靜電反應(yīng)（過于干燥）貼片（粘片）
        目的
?        將石蠟切片黏附在載玻片上，借水的張力和一定的溫度，使略皺的蠟片伸展平整，以便染色、鏡檢
        方法
?        水撈法
?        干粘法

染料與染色
        染料的分類
?        根據(jù)來源
?        天然染料
?        蘇木素、胭脂紅、靛青等
?        人工合成染料（煤焦油染料）
?        大都是從煤焦油中提取出來的
?        根據(jù)發(fā)色團(tuán)可以分為：亞硝基染料、硝基染料、偶氮染料（-N=N-）等
        根據(jù)化學(xué)反應(yīng)
?        堿性染料
?        大多是氯化物、硫酸鹽、醋酸鹽等
?        一般作為胞核染色：蘇木素
?        酸性染料
?        大多是鈉鹽，也可是鉀、鈣、銨鹽
?        作為胞漿染色：伊紅
?        中性染料：復(fù)合染料
?        酸、堿性染料混合后中和而成
?        如Wright染料、Giemsa染料
        根據(jù)染色的對象
?        胞核染料：蘇木素、胭脂紅等
?        胞漿染料：伊紅Y、苦味酸、苯胺藍(lán)等
?        脂肪染料：蘇丹III、蘇丹IV等




 

染色的原理
        是物理與化學(xué)的綜合作用的結(jié)果
?        以前有物理學(xué)說和化學(xué)學(xué)說
        物理作用
?        毛細(xì)管作用與滲透作用
?        組織有許多小孔
?        吸收或溶液作用
?        如蘇丹染料溶于脂肪內(nèi)
?        吸附作用
?        組織浸于染液中，色素粒子被組織吸附，進(jìn)入組織粒子的間隙中
        化學(xué)作用
?        根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的不同化學(xué)成分，對染料有不同的親和力，因此細(xì)胞有選擇性的著色能力，使細(xì)胞的不同成分染成不同顏色
?        細(xì)胞內(nèi)有酸性部分和堿性部分的區(qū)別
        酸性部分（核酸）易被堿性染料所染
        堿性部分（細(xì)胞質(zhì)）易被酸性染料所染
        嗜酸性與嗜堿性
?        染色與PH值有較大關(guān)系
        蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)
        在PH值高于組織的等電點(diǎn)時(shí)，組織呈酸性，染堿性染料
        在PH值低于組織的等電點(diǎn)時(shí)，則剛好相反

媒染劑、促染劑與分化劑
        媒染劑
?        能與染料和組織結(jié)合，使染料與組織發(fā)生染色現(xiàn)象，促進(jìn)染色能力和生成色淀的金屬離子的鹽
?        一般是二價(jià)或三價(jià)金屬的鹽或氫氧化物，常用的是鋁鹽、鐵鹽與明礬
?        需要媒染劑的染料稱為媒染染料，如蘇木素等
?        人工合成染料可不用媒染劑，但使用后往往可得較好的效果
        促染劑
?        不參與染色反應(yīng)，增強(qiáng)染色能力
?        如硼砂洋紅中的硼砂
        分化劑
?        脫色劑
?        脫掉組織和切片過染的染料
?        酸性分化劑
        冰醋酸：多用于合成的煤焦油染料
        鹽酸：多用于蘇木精
?        媒染分化劑
        鐵礬
?        氧化劑
        能把組織上所有的染料無選擇地氧化為無色物質(zhì)
        簡單的漂白作用，緩慢
        如鉻酸、重鉻酸鉀等

封藏
        目的
?        使切片能*保存便于鏡檢
        要求
?        能與透明劑相混合
?        對染料無影響
?        折光率與玻片相似
?        具有粘性
        常用的封藏劑
?        樹膠
?        淡黃色液體，可溶解于二甲苯、苯、氯仿等
?        二甲苯、苯等易揮發(fā)，干固較快，無褪色等不良后果
?        折光率接近玻片，透明度好，幾乎無色，干后堅(jiān)硬牢固
?        注意事項(xiàng)
        不可加熱，否則變?yōu)樯詈稚?br />        制成中性：酸性使堿性染料脫色