一．相差鏡檢法(Phasecontrast)

在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過(guò)程中,相差鏡檢術(shù)的發(fā)明成功,是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就.我們知道,人眼只能區(qū)分光波的波長(zhǎng)(顏色)和振幅(亮度),對(duì)于無(wú)色通明的生物標(biāo)本,當(dāng)光線通過(guò)時(shí),波長(zhǎng)和振幅變化不大,在明場(chǎng)觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本.

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象,將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?即使是無(wú)色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見(jiàn).這大大便利了活體細(xì)胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡.

相差顯微鏡的基本原理是,把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn).光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來(lái)的光路,同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng)),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差.在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處:

1.環(huán)形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上.

2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.分為兩種:

1.A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱(chēng)負(fù)反差).

2.B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱(chēng)正反差),結(jié)構(gòu)比周?chē)橘|(zhì)更加變暗

二．暗視野觀察(Darkfield)

暗視野實(shí)際是暗場(chǎng)照明發(fā).它的特點(diǎn)和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場(chǎng)成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象.

暗視野的原理是根據(jù)光學(xué)上的丁道爾現(xiàn)象,微塵在強(qiáng)光直射通過(guò)的情況下,人眼不能觀察,這是因?yàn)閺?qiáng)光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見(jiàn).

m..m暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡.它的特點(diǎn)是不讓光束由下至上的通過(guò)被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進(jìn)入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠(yuǎn)高于明視野觀察,達(dá)0.02—0.004

三．明視野觀察(Brightfield)

明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應(yīng)用于病理、檢驗(yàn),用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能.

四.偏光顯微鏡(Polarizingmicroscope)

偏光顯微鏡的特點(diǎn)

偏光顯微鏡是鑒定物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)光學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡.凡具有雙折射的物質(zhì),在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色發(fā)來(lái)進(jìn)行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡.

偏光顯微鏡的特點(diǎn),就是將普通改變?yōu)槠膺M(jìn)行鏡檢的方法,以鑒別某一物質(zhì)是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性).

雙折射性是晶體的基本特性.因此,偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物,化學(xué)等領(lǐng)域.在生物學(xué)和植物學(xué)也有應(yīng)用.

五．微分干涉稱(chēng)鏡檢術(shù)(DifferentialinterferencecontrastDIC)

微分干涉鏡檢術(shù)出現(xiàn)于60年代,它不僅能觀察無(wú)色透明的物體,而且圖象呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術(shù)所不能達(dá)到的某些優(yōu)點(diǎn),觀察效果更為逼真.

原理;

微分干涉稱(chēng)鏡檢術(shù)是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來(lái)分解光束.分裂出來(lái)的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等,光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過(guò)被檢物體,在相位上略有差別.由于兩光束的裂距極小,而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象,使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺(jué).

DIC顯微鏡的物理原理不同于相差顯微鏡,技術(shù)設(shè)計(jì)要復(fù)雜得多.DIC利用的是偏振光,有四個(gè)特殊的光學(xué)組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer).偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面,使光線發(fā)生線性偏振.在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角.聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向.最初兩束光相位一致,在穿過(guò)標(biāo)本相鄰的區(qū)域后,由于標(biāo)本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發(fā)生了光程差.在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)偌瑪斯斯棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束.

生物顯微鏡的幾種觀察方法都有什么作用?