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相差顯微鏡的介紹及說明
相差顯微鏡介紹:
相差顯微鏡又稱相襯顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的,用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡?;罴?xì)胞和未染色的生物標(biāo)本,因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同,光波通過時,波長和振幅并不發(fā)生變化,僅相位發(fā)生變化(振幅差),這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差,并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象,把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌, 用帶相板的物鏡代替普通物鏡,并帶有一個合軸用的望遠(yuǎn)鏡。
理論基礎(chǔ)
相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時間上,光的波動所達(dá)到的位置。一般由于被檢物體(如不染色的細(xì)胞)所能產(chǎn)生的相差太小,肉眼很難分辨,只有在變相差為振幅差(明暗差)之后才能被區(qū)分。相差決定于光波所通過介質(zhì)的折射率之差及其厚度,等于折射率與厚度的乘積之差(即光程之差)。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。
細(xì)胞生物學(xué)的研究儀器中 相差顯微鏡,透射電子顯微鏡和掃描隧道電子顯微鏡的設(shè)計(jì)或發(fā)明獲得了諾貝爾獎。
差別
相差顯微鏡有四個特殊結(jié)構(gòu):相差物鏡、具有環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡和綠色的濾光片。綠色濾光片作用是:縮小照明光線波長范圍,減少由于照明光線的波長不同引起的相位變化。
用途
觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。
基本原理
利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別,把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度)的差別,經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片,有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。
把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差。在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個特殊之處:
1.環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。
2.相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:
(1)A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱負(fù)反差)。
(2)B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。
3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡:用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面*吻合。
修理維護(hù)
相差顯微鏡使用中的幾個問題:
(1)相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’<n或n’>n時得到象的明暗反差正好相反,稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時是無法識別的,隨著δ的增大反差變大,當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時,這個轉(zhuǎn)變值約為0.55λ,用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
(2)暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過程中,某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時,并不是光的損失,而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點(diǎn),它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察,當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應(yīng),指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時,該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。
(3)樣品厚度的影響 當(dāng)進(jìn)行相差觀察時,樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄,當(dāng)采用較厚的樣品時,樣品的上層是很清楚的,深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。
(4)蓋玻片和載玻片的影響樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片,否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求,當(dāng)有劃痕,厚薄不均或凹凸不平時會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。