使用高效液相色譜儀時(shí)需要注意的問(wèn)題是什么？

一、樣品預(yù)處理與進(jìn)樣

• 樣品過(guò)濾與脫氣

• 樣品需用 0.22μm 或 0.45μm 濾膜過(guò)濾，避免顆粒雜質(zhì)堵塞色譜柱或進(jìn)樣閥。

• 蛋白質(zhì)、多糖等生物樣品需離心（10000rpm 以上）后取上清，或用固相萃?。⊿PE）預(yù)處理，防止柱效下降。

• 進(jìn)樣量控制

• 進(jìn)樣量不宜超過(guò)色譜柱容量（通?！?0μL），避免過(guò)載導(dǎo)致峰展寬或拖尾。

• 自動(dòng)進(jìn)樣器需定期校準(zhǔn)針位置，防止進(jìn)樣針磨損或污染。

二、流動(dòng)相配制與管理

• 溶劑純度與混合

• 使用 HPLC 級(jí)純?nèi)軇ㄈ缂状?、乙腈），水相需用超純水?8.2MΩ?cm），避免無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)物殘留。

• 混合流動(dòng)相時(shí)（如甲醇 - 水），需提前超聲脫氣 10-15 分鐘，或使用在線脫氣機(jī)，防止氣泡進(jìn)入系統(tǒng)導(dǎo)致基線波動(dòng)。

• pH 值與緩沖液

• 流動(dòng)相 pH 需控制在色譜柱耐受范圍內(nèi)，超過(guò)范圍易導(dǎo)致固定相流失。

• 緩沖液（如磷酸鹽、乙酸銨）需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)時(shí)間放置滋生微生物，使用后及時(shí)沖洗系統(tǒng)（如用 10% 甲醇水沖洗 30 分鐘）。

三、色譜柱維護(hù)與使用

• 柱溫與流速控制

• 柱溫需穩(wěn)定（如 30℃±0.5℃），避免溫度波動(dòng)影響保留時(shí)間和分離度；流速不宜超過(guò)色譜柱最大耐受壓力（通?！?00bar），建議從 0.5mL/min 逐步升至目標(biāo)流速。

• 柱效監(jiān)測(cè)與再生

• 定期用標(biāo)準(zhǔn)品（如甲苯、萘）測(cè)試柱效（理論塔板數(shù) N≥5000/m），若柱效下降 50% 以上，需用 10% 甲醇水→純甲醇→純乙腈依次沖洗（各 60 分鐘）再生，或用專用柱再生試劑。

• 長(zhǎng)期不用時(shí)，色譜柱需用純甲醇或乙腈封存，兩端密封，避免干燥導(dǎo)致固定相塌陷。

四、儀器操作規(guī)范

• 開(kāi)機(jī)與關(guān)機(jī)順序

• 開(kāi)機(jī)：先開(kāi)泵→柱溫箱→檢測(cè)器→工作站，待系統(tǒng)平衡（基線穩(wěn)定）后再進(jìn)樣；關(guān)機(jī)：先降流速至 0，用 10% 甲醇水沖洗系統(tǒng) 30 分鐘→純有機(jī)相沖洗 15 分鐘→關(guān)閉各模塊。

• 壓力異常處理

• 若壓力突然升高（如 > 200bar），可能是柱前篩板堵塞或流動(dòng)相結(jié)晶，需逐段排查（泵→進(jìn)樣閥→色譜柱→檢測(cè)器），用 5% 稀硝酸沖洗堵塞部件（注意避免接觸色譜柱）；若壓力波動(dòng)大，檢查泵頭是否有氣泡或柱塞密封圈磨損。

五、檢測(cè)器維護(hù)

• 紫外檢測(cè)器（UV）

• 避免長(zhǎng)時(shí)間使用高波長(zhǎng)（如 > 400nm）光源，防止氘燈壽命縮短（正常壽命約 2000 小時(shí)）；定期用異丙醇沖洗流通池（1mL/min，30 分鐘），清除鹽結(jié)晶或樣品殘留。

• 熒光檢測(cè)器（FLD）

• 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)需避開(kāi)流動(dòng)相吸收范圍（如甲醇在 < 200nm 有吸收），樣品需避光處理，防止熒光淬滅。

六、日常維護(hù)與故障排查

• 泵系統(tǒng)保養(yǎng)

• 每周更換泵頭清洗液（10% 異丙醇），每 3 個(gè)月更換柱塞密封圈和主動(dòng)閥密封圈，防止漏液或壓力不穩(wěn)。

• 數(shù)據(jù)記錄與備份

• 分析數(shù)據(jù)需實(shí)時(shí)保存，定期備份工作站數(shù)據(jù)庫(kù)，避免因軟件崩潰導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失；色譜圖需標(biāo)注樣品信息、方法參數(shù)（如流動(dòng)相比例、柱溫），便于追溯。

七、安全與環(huán)保

• 有機(jī)溶劑防護(hù)

• 操作時(shí)佩戴手套、護(hù)目鏡，實(shí)驗(yàn)室需通風(fēng)良好，避免乙腈等揮發(fā)氣體積聚；廢液需分類收集（有機(jī)相、水相、含酸 / 堿廢液），交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

• 電氣安全

• 儀器需接地良好，避免在潮濕環(huán)境下操作，維修時(shí)斷開(kāi)電源，防止觸電。

總結(jié)

HPLC 的核心是 “精密控制與細(xì)節(jié)管理"，從樣品前處理到儀器參數(shù)設(shè)置，每一步均可影響結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。定期維護(hù)（如每月系統(tǒng)性沖洗系統(tǒng)、半年校準(zhǔn)檢測(cè)器）可顯著降低故障率，延長(zhǎng)儀器使用壽命。若遇到復(fù)雜故障（如色譜柱不可逆污染），建議聯(lián)系廠商工程師協(xié)助處理

如何正確使用液相色譜儀