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流式細胞儀的使用操作細節(jié)

來源:梁山縣德行二手設(shè)備購銷部   2025年06月09日 11:02   23

流式細胞儀的使用操作細節(jié)

流式細胞儀是一種高精度的細胞分析和分選設(shè)備,其操作流程需嚴格遵循規(guī)范以確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和設(shè)備穩(wěn)定性。以下是流式細胞儀的詳細使用操作細節(jié)及注意事項:

一、操作前準(zhǔn)備

1. 環(huán)境與設(shè)備檢查

  • 實驗室環(huán)境:保持室溫20~25℃,濕度40%~70%,避免強光直射和劇烈震動,減少灰塵污染(建議配備空氣凈化器)。

  • 設(shè)備外觀檢查

    • 確認管路無泄漏、堵塞或老化(尤其是鞘液、廢液管路)。

    • 檢查激光光源狀態(tài)(如指示燈是否正常,部分儀器需預(yù)熱 30 分鐘以上)。

    • 確保液流系統(tǒng)(鞘液桶、廢液桶)清潔,鞘液需使用超純水或?qū)S们室?/span>,且過濾膜定期更換(通常每 1~3 個月一次)。

2. 樣本制備

  • 單細胞懸液制備

    • 組織樣本需通過酶消化、機械研磨或濾網(wǎng)過濾(推薦 40~70 μm 細胞篩)制成單細胞懸液,避免細胞團塊堵塞管路。

    • 血液 / 體液樣本需抗凝處理(如 EDTA、肝素),避免細胞凝集。

  • 染色要求

    • 熒光抗體染色需在4℃避光條件下孵育 15~30 分鐘,染色后用 PBS 洗滌 2 次,減少非特異性結(jié)合。

    • 活細胞染色需注意染料毒性(如 PI 僅用于死細胞染色),染色后盡快上機(建議 1 小時內(nèi))。

  • 細胞濃度調(diào)整:通過血球計數(shù)板或自動細胞計數(shù)器調(diào)整細胞濃度至1×10?~5×10? cells/mL,避免過高濃度導(dǎo)致液流不穩(wěn)定或管路堵塞。

二、開機與系統(tǒng)校準(zhǔn)

1. 開機流程

  1. 接通電源,依次開啟計算機、流式細胞儀主機、激光器(若為汞燈等需預(yù)熱)。

  2. 啟動控制軟件(如 FlowJo、BD FACSDiva),連接設(shè)備并初始化系統(tǒng)。

  3. 運行液流校準(zhǔn)程序

    • 注入鞘液,觀察壓力值是否穩(wěn)定(通常為 15~30 psi,依儀器型號而定)。

    • 執(zhí)行 “液流對齊”(Fluidic Alignment),通過熒光微球(如 Flow Cytometry Standard Beads)調(diào)整激光聚焦點,確保單細胞流通過檢測區(qū)域。

2. 光路校準(zhǔn)與補償設(shè)置

  • 熒光校準(zhǔn):使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球(如 Calibration Beads)校準(zhǔn)各通道熒光強度,確保不同時間點數(shù)據(jù)的一致性。

  • 光譜補償(Compensation)

    • 由于熒光染料發(fā)射光譜重疊,需通過單染樣本(如僅標(biāo)記 FITC 的細胞)設(shè)置補償參數(shù),消除通道間串?dāng)_。

    • 示例:若 FITC 信號漏入 PE 通道,需在軟件中調(diào)整 “FITC→PE” 補償值至陰性群體 MFI<100。

三、樣本檢測操作

1. 上樣與參數(shù)設(shè)置

  • 手動進樣

    • 將樣本管放入進樣架,選擇 “手動模式”,設(shè)置流速(低速:≤50 μL/min,高速:≥200 μL/min),推薦低速以減少誤差。

    • 丟棄前 200~500 μL 樣本(避免氣泡和邊緣效應(yīng)),待流式圖穩(wěn)定后開始采集數(shù)據(jù)。

  • 自動進樣(如有)

    • 編輯進樣列表,設(shè)置樣本名稱、采集時間(如采集 10,000 個細胞或持續(xù) 60 秒),確保樣本針位置準(zhǔn)確。

  • 檢測參數(shù)設(shè)置

    • 必選參數(shù):前向散射光(FSC,反映細胞大?。?cè)向散射光(SSC,反映細胞內(nèi)部復(fù)雜性)、熒光參數(shù)(如 FL1~FL4 對應(yīng)不同染料)。

    • 采集模式:選擇 “對數(shù)放大”(適用于熒光信號)或 “線性放大”(適用于 FSC/SSC),根據(jù)樣本特性調(diào)整電壓(PMT 值),使陰性群體位于熒光軸左側(cè) 1/3 處。

2. 數(shù)據(jù)采集與監(jiān)控

  • 實時監(jiān)控

    • 觀察 FSC/SSC 散點圖,排除細胞碎片(低 FSC/SSC)和聚集體(高 FSC 且 SSC 變異大),可通過設(shè)門(Gating)僅采集單細胞群體。

    • 監(jiān)測廢液桶容量,避免滿溢污染設(shè)備(建議每檢測 5~10 個樣本傾倒一次)。

  • 異常處理

    • 若出現(xiàn) “液流中斷” 報警,需檢查鞘液是否不足、管路是否漏氣或樣本中有雜質(zhì),必要時用0.1% Triton X-100沖洗管路后重新校準(zhǔn)。

    • 熒光信號突然降低時,檢查激光器功率、濾光片位置或染色是否失效。

四、關(guān)機與維護

1. 關(guān)機流程

  1. 清洗管路

    • 檢測結(jié)束后,用PBS 或?qū)S们逑匆?/span>沖洗進樣針和管路(建議運行清洗程序 5~10 分鐘),清除殘留細胞和染料。

    • 若檢測高濃度樣本或黏性液體(如腫瘤組織裂解液),需先用3% 次氯酸鈉溶液沖洗 3 分鐘,再用超純水沖洗干凈。

  2. 關(guān)閉系統(tǒng)

    • 依次關(guān)閉激光器、主機電源、計算機,蓋好儀器防塵罩。

    • 記錄使用日志,包括開機時間、檢測樣本數(shù)、耗材更換情況等。

2. 日常維護要點

  • 每日維護

    • 更換廢液桶,用 75% 乙醇擦拭進樣針和樣本架,避免交叉污染。

    • 檢查鞘液剩余量,低于 1/3 時及時補充,確保次日正常運行。

  • 每周維護

    • 清洗鞘液桶和廢液桶,用去離子水沖洗后干燥,避免微生物滋生。

    • 檢查激光校準(zhǔn)狀態(tài),用標(biāo)準(zhǔn)微球驗證變異系數(shù)(CV 值應(yīng)<5%)。

  • 每月維護

    • 更換鞘液過濾膜(若為可更換式),清洗液流系統(tǒng)內(nèi)部組件(需專業(yè)人員操作)。

    • 對光學(xué)元件(如透鏡、濾光片)進行除塵,避免灰塵影響檢測靈敏度。

五、安全與注意事項

  1. 生物安全

    • 處理感染性樣本(如臨床標(biāo)本、病毒感染細胞)時,需在生物安全柜中操作,佩戴手套和護目鏡,避免樣本濺出。

    • 廢液需經(jīng)高壓滅菌或含氯消毒劑處理后再丟棄,防止生物污染。

  2. 激光安全

    • 避免直視激光光源(尤其是紫外激光),操作時關(guān)閉儀器艙門,維修需由持證人員完成。

  3. 耗材管理

    • 使用專用樣本管(如聚苯乙烯圓底管),避免使用玻璃管或帶蓋試管(可能導(dǎo)致進樣針損壞)。

    • 熒光微球和抗體需避光保存于 4℃,避免反復(fù)凍融影響性能。

六、常見問題與解決策略

問題 可能原因 解決方法
液流不穩(wěn)定 鞘液不足、管路漏氣 補充鞘液,檢查管路連接
檢測信號弱 激光功率下降、染色效率低 校準(zhǔn)激光,優(yōu)化染色條件(濃度 / 時間)
細胞碎片過多 樣本制備不當(dāng)、儲存時間過長 重新制備單細胞懸液,縮短染色后上機時間
通道間補償異常 補償設(shè)置錯誤、微球過期 重新進行單染補償,更換新鮮校準(zhǔn)微球

總結(jié)

流式細胞儀的操作需兼顧標(biāo)準(zhǔn)化流程個性化調(diào)整,從樣本制備到數(shù)據(jù)采集的每一個環(huán)節(jié)都會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。定期維護設(shè)備、規(guī)范操作習(xí)慣,并結(jié)合軟件數(shù)據(jù)分析(如設(shè)門策略、統(tǒng)計學(xué)分析),可最大限度發(fā)揮流式細胞儀在細胞分析、免疫分型、凋亡檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用價值。新手需通過培訓(xùn)和反復(fù)實踐積累經(jīng)驗,必要時參考儀器說明書或聯(lián)系技術(shù)支持解決復(fù)雜問題。

 

關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)采集
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